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SIRT1在铜绿假单胞菌LPS诱导A549细胞凋亡中的作用研究

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SIRT1 在铜绿假单胞菌 LPS 诱导 A549 细胞凋亡中的作用研究
目的:铜绿假单胞菌属革兰氏阴性杆菌假单胞菌属,为条件致病菌,可产生多 种致病因子,包括一些酶类及毒素,例如:脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)等, 当机体免疫力低下时可引起严重的肺部感染。LPS 为铜绿假单胞菌的致病因素之 一,它在调节宿主和细菌之间起到关键性作用。
研究表明 LPS 可以诱导 A549 细胞发生凋亡,并促进细胞内活性氧产生增多。 文献报道,活性氧是细胞凋亡的原因之一,活性氧可引起氧化应激最终导致细胞 凋亡。
SIRT1 是一种具有 NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶活性的多功能转录调节因子, 它属于 Sir2 家族,对细胞的生存、凋亡、衰老等生理活动起着十分重要的调节作 用。研究表明 SIRT1 是一种抑制细胞凋亡的因子,可通过对 p53 去乙酰化的调控 从而抑制细胞凋亡。
本研究通过建立 LPS 诱导 A549 细胞凋亡模型,来分析在此过程中,SIRT1 在 铜绿假单胞菌 LPS 诱导 A549 细胞凋亡中的作用并探讨活性氧在 LPS 诱导 A549 细胞凋亡中的作用。方法:1.MTT 方法检测 LPS 在不同浓度及不同时间对 A549 细胞活力的影响。
2.用 Western blot 方法检测 LPS 在不同浓度及不同时间对 A549 细胞 SIRT1 蛋白表达情况的影响,采用细胞免疫荧光方法检测 A549 细胞内 SIRT1 蛋白的表达 定位情况。3.根据预实验的结果,我们选用 10μ g/ml LPS 处理 A549 细胞 48 小时 建立细胞凋亡模型,分别用 Hocehst 染色方法及 Annexin V-FITC 检测方法检测 A549 细胞凋亡情况,应用流式细胞仪检测 A549 细胞内活性氧产生情况,同时检测 SIRT1 及 p53 以及乙酰化 p53 的表达情况,并检测细胞凋亡相关因子 Bax 及 Bc12

的表达情况。 4.LPS 加药前,20μ M Res 预处理 A549 细胞 1 小时,过表达 SIRT1,运用
Annexin V-FITC 检测方法检测细胞凋亡并用流式细胞仪检测活性氧产生情况,并 检测 SIRT1、p53 以及乙酰化 p53 的表达情况。5.LPS 加药前,5mM NAM 预处理 A549 细胞 1 小时,运用 Annexin V-FITC 检测方法检测细胞凋亡并用流式细胞仪检测活 性氧产生情况,检测 SIRT1、p53 以及乙酰化 p53 的表达情况。
6.LPS 加药前,用 5mM NAC 预处理 A549 细胞 1 小时,运用 Annexin V-FITC 检 测方法检测细胞凋亡并用流式细胞仪检测活性氧产生情况,同时检测 SIRT1、p53 以及乙酰化 p53 的表达情况。结果:1.与对照组相比,LPS 可降低 A549 细胞的细 胞活力,并呈现时间及浓度依赖性。
当 LPS 作用时间为 48 小时,作用浓度为 10μ g/ml 时,细胞活力下降最明显。 2.本研究的细胞免疫荧光结果显示,SIRT1 主要在 A549 细胞核内表达。
Western blot 结果显示随着 LPS 浓度的增大,A549 细胞内的 SIRT1 表达显著 减少。10μ g/ml LPS 在最初的 6、12h,促进细胞内 SIRT1 的表达上调,但无统计 学意义,随着时间的延长,在 24h、48h 后细胞内的 SIRT1 的表达逐渐下调,并于 48h 细胞内 SIRT1 表达下调最明显并具有显著的统计学意义。
3.根据实验结果 2 的数据,我们选择了 LPS 的作用时间为 48 小时,LPS 药物 浓度为 10μ g/ml 来检测 SIRT1 及 p53 以及乙酰化 p53 的表达情况,结果显示 LPS 可诱导 A549 细胞发生凋亡,并且随着时间的延长细胞内活性氧的产生不断增多, 而 SIRT1 的表达下降但 p53 以及乙酰化的 p53 表达升高。4.为进一步探讨 SIRT1 在铜绿假单胞菌 LPS 诱导 A549 细胞凋亡中的作用研究,我们选用 Res (SIRT1 的 激动剂)进行预处理 A549 细胞,实验分为四组,包括 DMSO 组、DMSO+LPS 组、Res

组、Res+LPS 组,结果表明,Res 对 A549 细胞的活力无影响,但可促进 A549 细胞内 的 SIRT1 表达,Res+LPS 组与 DMSO+LPS 组相比,凋亡的细胞减少同时细胞内的活 性氧产生也显著减少。
5.我们选用了 NAM (SIRT1 的抑制剂)来探讨 SIRT1 在铜绿假单胞菌 LPS 诱导 A549 细胞凋亡中的作用,NAM 可抑制 SIRT1 在 A549 细胞内的表达,我们根据预实 验的结果选取了 5mM 为 NAM 的预处理浓度,实验分为 NAM 组与 NAM+LPS 两组,实验 结果表明,NAM+LPS 组与 NAM 组相比较,细胞凋亡的数量增多,细胞内活性氧的产 生也增多了,同时 SIRT1 的表达下降而 p53 及乙酰化的 p53 表达升高。6.最后, 为探讨活性氧对 A549 细胞凋亡中产生的作用,我们选用 NAC(活性氧的清除剂)进 行预处理 A549 细胞,实验分为 NAC 组与 NAC+LPS 组,结果表明 NAC 可减少细胞内 活性氧的产生,细胞凋亡减少,同时 SIRT1 表达增多,而 p53 及乙酰化的 p53 表达 减少。
结论:1.LPS 可诱导 A549 细胞发生凋亡,促进细胞内的活性氧产生增多,LPS 可通过对 SIRT1 的抑制而促进 A549 细胞的凋亡。2.Res 减轻了 A549 细胞的凋亡, 主要是通过 Res 介导的 SIRT1 对 p53 去乙酰化调控实现的。
3.NAM 加重了 A549 细胞的凋亡,主要是通过 NAM 介导的 SIRT1 对 p53 调控实 现的。4.NAC 可减少细胞内活性氧的产生,抑制细胞的凋亡,并激活了 SIRT1 却抑 制了 p53 以及乙酰化 p53 的表达。
5. SIRT1 在铜绿假单胞菌 LPS 诱导 A549 细胞凋亡中起着重要作用,SIRT1 通过去乙酰化 p53 调控 p53 的作用从而抑制细胞的凋亡,LPS 却抑制 SIRT1 了的 表达,从而促进了细胞的凋亡。




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